免疫分析儀問世已近40年，其技術(shù)原理發(fā)展至今已經(jīng)十分成熟了，尤其在21-22新冠浪潮，已有多家企業(yè)選擇熒光免疫分析路線。

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熒光免疫分析儀，由于一直采用的是免疫層析原理，所以也被經(jīng)常叫為熒光免疫層析分析儀，它的原理主要基于抗原-抗體特異性免疫反應(yīng)以及熒光標(biāo)記技術(shù)。它利用抗原與抗體之間的高度特異性結(jié)合來檢測和定量目標(biāo)分子。當(dāng)待測物與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合后，通過光源照射，熒光標(biāo)記物會(huì)受激發(fā)而發(fā)射熒光。這些熒光信號(hào)隨后被采集并用于定量分析待測物的濃度。

原理詳情

免疫熒光技術(shù)的原理是在硝酸纖維素膜的測試區(qū)（T）包被 BSA 與抗原的偶聯(lián)物，標(biāo)記墊上含有預(yù)先包被的熒光標(biāo)記抗體。

檢測時(shí)，首先用處理試劑將樣本中的抗原與標(biāo)記墊上的熒光標(biāo)記抗體發(fā)生結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，復(fù)合物在層析作用下沿著硝酸纖維素膜向前擴(kuò)散至包被有另一種單克隆抗體的檢測區(qū)，從而形成雙抗體夾心復(fù)合物，而游離的熒光抗體則附著在質(zhì)控區(qū)。

當(dāng)檢測卡插入熒光免疫分析儀后，光源照射到檢測卡上，通過模塊控制LED的發(fā)光強(qiáng)度以符合測量的強(qiáng)度要求，分析儀自動(dòng)掃描檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光強(qiáng)度，傳感器輸出信號(hào)經(jīng)放大和濾波處理后，進(jìn)入轉(zhuǎn)換芯片轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)交給處理器進(jìn)行處理，通過兩種熒光強(qiáng)度的比值計(jì)算待測樣本中的抗原含量。

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特點(diǎn)

免疫熒光分析技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、耗材保存簡單、操作簡便等特點(diǎn)，在床旁即時(shí)檢測（POCT）領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，比如檢測病毒、激素、毒品、C- 反應(yīng)蛋白、糖化血紅蛋白、甲胎蛋白、降鈣素原等。

光路檢測及組成

作為免疫熒光分析儀的核心，在光學(xué)暗箱結(jié)構(gòu)中，一般由光源、激發(fā)光路、采集光路、光電傳感器、放大系統(tǒng)等組成。

光路有共聚焦光路和非共聚焦光路

共聚焦光路

光源產(chǎn)生與熒光標(biāo)記物的吸收波長相近的單色光，單色光通過激發(fā)光路，照射在試劑條特定的掃描點(diǎn)上。掃描點(diǎn)附近的熒光物質(zhì)受激發(fā)發(fā)射熒光，采集光路（也叫接受光路）將熒光收集并聚焦到光電探測器的有效接收靶面內(nèi)。采集光路除了透鏡實(shí)現(xiàn)聚焦功能外，還通過濾光片來濾除非特定波段光的干擾。

非共聚焦光路

非共聚焦光路也叫V型光路，成本相對較低，通過兩個(gè)相同的光源分別與試劑條水平面成 45°和 135°夾角，對稱的激發(fā)光源經(jīng)過透鏡和濾光片等光學(xué)器件后，聚焦于試劑條平面形成光斑。激發(fā)出的熒光則沿著垂直于試劑條的光路通過濾光片、透鏡等光學(xué)器件到達(dá)光闌，并被光電探測器采集。光電探測器接受光信號(hào)后，將熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為微弱電信號(hào)。為了能夠有效的測量微弱電信號(hào)的值，系統(tǒng)中的信號(hào)放大電路對電信號(hào)進(jìn)行放大。之后模數(shù)轉(zhuǎn)換器將電信號(hào)結(jié)果轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)并送給送到微處理器進(jìn)行計(jì)算和定量分析。

濾光片選擇

激發(fā)濾光片：位于光源和樣品之間，用于選擇性地傳遞激發(fā)波長的光線，濾除其他非激發(fā)波長的光線，激發(fā)光路一般選用中心波長低于600nm的濾光片。在熒光免疫層析中，激發(fā)光通常是紫外光或特定波長的光，激發(fā)濾光片確保只有這些波長的光線能夠照射到樣品上，從而激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)。

發(fā)射濾光片：位于樣品和檢測器之間，用于選擇性地傳遞發(fā)射波長的熒光光線，濾除其他非熒光波長的光線。樣品受到激發(fā)光照射后發(fā)出的熒光光線會(huì)經(jīng)過發(fā)射濾光片，只有特定波長的熒光光線能夠通過，從而確保檢測器接收到的是純凈的熒光信號(hào)。根據(jù)熒光波長，采集光路一般選用中心波長在610~620nm濾光片。

二向色鏡（二色鏡），通過反射或透射特定波長的光線，實(shí)現(xiàn)激發(fā)光和發(fā)射熒光的分離。二向色鏡通常與激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片一起使用，以確保激發(fā)光和熒光信號(hào)在光路中不相互干擾。

（熒光免疫BP600窄帶濾光片）

濾光片特性要求

高截止陡度：確保濾光片在截止波長處具有陡峭的截止特性，以減少光譜重疊和干擾。

高透過率：在所需波長范圍內(nèi)具有高的透過率，以提高信號(hào)的強(qiáng)度和靈敏度。

高定位精度：確保濾光片在光學(xué)系統(tǒng)中的準(zhǔn)確位置，以保證光譜的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

高截止深度：通常要求濾光片截止深度在OD5（光密度）以上，以有效阻擋不需要的光線。

優(yōu)良的環(huán)境穩(wěn)定性：濾光片應(yīng)能在各種環(huán)境條件下保持穩(wěn)定的性能，如溫度、濕度和光照等。

在熒光免疫層析分析儀中，濾光片通常被組合使用，以形成完整的熒光檢測系統(tǒng)。例如，在檢測過程中，激發(fā)濾光片首先選擇性地傳遞激發(fā)光至樣品，樣品受到激發(fā)后發(fā)出熒光，然后熒光信號(hào)經(jīng)過發(fā)射濾光片濾除其他非熒光波長的光線，最后純凈的熒光信號(hào)被檢測器接收并進(jìn)行處理分析。同時(shí)，二向色鏡在光路中起到關(guān)鍵作用，確保激發(fā)光和熒光信號(hào)的有效分離和傳遞。

綜上所述，熒光免疫層析分析儀中的濾光片是確保分析過程準(zhǔn)確性和靈敏性的重要組成部分。通過選擇合適的濾光片類型和參數(shù)，可以優(yōu)化熒光檢測系統(tǒng)的性能并提高檢測結(jié)果的可靠性。