倒置熒光顯微鏡是一種電費(fèi)常規(guī)顯微鏡的一種特殊分類，結(jié)合了倒置光路設(shè)計與熒光成像技術(shù)，其物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來，由熒光附件與顯微鏡有機(jī)結(jié)合構(gòu)成的顯微鏡。激發(fā)光從物鏡向上落射到標(biāo)本表面，被反射到物鏡中并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進(jìn)入物鏡，經(jīng)雙色束分離器使激發(fā)光和熒光分開而成像。物鏡和聚光鏡的工作距離很長，能直接對培養(yǎng)皿中的被檢物體進(jìn)行顯微觀察和研究。

（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）

倒置熒光顯微鏡廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞動態(tài)觀測、免疫熒光分析及三維組織成像等領(lǐng)域。其光學(xué)元件的設(shè)計與配置直接決定了熒光信號的采集效率、信噪比及分辨率，下面我們將簡單為大家介紹關(guān)于其應(yīng)用的光學(xué)元件。

倒置熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)由激發(fā)光路、發(fā)射光路、物鏡系統(tǒng)和輔助光學(xué)元件等部分組成，每個光學(xué)元件在熒光成像過程中都承擔(dān)著關(guān)鍵作用。以下對各部分光學(xué)元件的類型、參數(shù)、功能及加工要求進(jìn)行詳細(xì)說明：

（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）

一、激發(fā)光路光學(xué)元件

激發(fā)光路的核心元件包括激發(fā)濾光片和二向色鏡。激發(fā)濾光片通常采用帶通濾光片（Bandpass Filter），其中心波長需根據(jù)熒光染料特性選擇，例如480±5nm用于GFP激發(fā)，帶寬一般為15-25nm（半高寬，F(xiàn)WHM），在中心波長處的透光率需大于90%，同時要求對非目標(biāo)波長的截止深度達(dá)到OD6，以有效阻斷雜散光。該濾光片的作用是選擇性透過特定波長范圍的激發(fā)光，其加工過程中需特別注意膜層要能耐受高功率光源（如汞燈或激光）的熱效應(yīng)，并且邊緣需進(jìn)行消光處理（如采用黑漆密封）以防止漏光。

（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）

二向色鏡（分光鏡）多采用長波通二向色鏡（Longpass Dichroic Mirror），其截止波長通常設(shè)置為500nm，能夠反射波長小于500nm的激發(fā)光（反射率＞95%）同時透射波長大于500nm的發(fā)射熒光信號（透射率＞90%）。該元件的關(guān)鍵作用是實(shí)現(xiàn)激發(fā)光與發(fā)射光的分離，在加工時需要嚴(yán)格控制入射角（通常為45°±2°），基片表面平整度要求達(dá)到λ/10（@632.8nm）以避免波前畸變。

二、發(fā)射光路光學(xué)元件

發(fā)射光路主要包括發(fā)射濾光片和場鏡。發(fā)射濾光片可選擇帶通型或長波通型，帶通型的典型參數(shù)為中心波長520±5nm，帶寬40nm（適用于GFP發(fā)射），長波通型的截止波長一般為515nm，兩者都要求對激發(fā)光殘留的截止深度達(dá)到OD6。該元件的主要功能是分離目標(biāo)熒光信號并抑制干擾，加工時需確保其光譜與激發(fā)濾光片無重疊，同時要考慮斜入射時的波長偏移（中心波長偏移需小于2nm@5°）。

場鏡（Tube Lens）采用消色差復(fù)合透鏡設(shè)計，焦距通常為180-200mm以匹配物鏡的無限遠(yuǎn)校正系統(tǒng)，在400-700nm波段的透過率需大于95%，全視場波前差小于λ/4。其作用是將物鏡形成的無限遠(yuǎn)像聚焦至相機(jī)靶面，加工時需要重點(diǎn)校正軸向色差（如F線和C線的焦點(diǎn)重合），并保證邊緣視場的MTF在200lp/mm時大于0.6。

三、物鏡光學(xué)元件

熒光物鏡由多組鏡片構(gòu)成：前組采用半球形高透氟化鈣（CaF?）單透鏡用于校正紫外色散；中組為低熒光玻璃膠合消色差組（如FK61/SF11組合）；后組則使用高折射率鑭系玻璃（如LaK10）。其數(shù)值孔徑（NA）范圍為0.7-1.4（油鏡），工作距離為0.1-2mm（高NA物鏡更短），在設(shè)計波段的透過率需大于80%。該物鏡需要高效收集微弱的熒光信號并成像，加工時要求透鏡偏心小于0.005mm以避免像散，膠合層需無氣泡（顯微鏡檢測缺陷小于5μm）。

（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）

四、輔助光學(xué)元件

聚光鏡采用長工作距離消色差設(shè)計，NA匹配范圍為0.3-0.7（可調(diào)光闌），工作距離不小于30mm以適應(yīng)培養(yǎng)皿厚度。其作用是提供均勻照明并支持相差/微分干涉觀察，加工時需校正球差（補(bǔ)償培養(yǎng)皿厚度），表面鍍增透膜（反射率小于0.5%@400-700nm）。

調(diào)焦補(bǔ)償鏡組為移動式雙膠合透鏡，位移量±5mm用于補(bǔ)償樣品容器厚度差異，要求全行程像差變化導(dǎo)致的波前差小于λ/10。加工時需保證導(dǎo)軌移動直線度小于1μm/10mm，透鏡偏心敏感度小于0.01mm。

（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）

五、光學(xué)加工核心要求

材料選擇方面，紫外波段需使用熔石英或氟化鈣，可見光波段用BK7/FK61等玻璃，需避免含自發(fā)熒光的材料（如某些鑭系玻璃）。鍍膜技術(shù)要求激發(fā)/發(fā)射濾光片采用硬質(zhì)氧化物膜（如Ta?O?/SiO?交替層），物鏡需鍍寬帶增透膜（平均反射率小于0.3%）。裝調(diào)公差要求嚴(yán)格：物鏡透鏡間隔公差±0.01mm，濾光片傾斜角公差小于0.5°。所有光學(xué)元件需通過85℃/85%RH老化測試以確保膜層穩(wěn)定性。

這些光學(xué)元件的精確設(shè)計和制造是保證熒光顯微鏡高信噪比、高分辨率成像的關(guān)鍵，需要在整個加工過程中嚴(yán)格控制材料選擇、光學(xué)設(shè)計、鍍膜工藝和裝調(diào)精度等各個環(huán)節(jié)。

六、特殊光學(xué)元件

TIRF棱鏡（全內(nèi)反射熒光）

材質(zhì)：高折射率玻璃（如LaSFN9，n=1.85）。

入射角調(diào)節(jié)：精密旋轉(zhuǎn)機(jī)構(gòu)（角度分辨率±0.1°），實(shí)現(xiàn)50-200nm薄層激發(fā)。

共聚焦轉(zhuǎn)盤（Yokogawa CSU系列）

微透鏡陣列：直徑500μm，將激光掃描轉(zhuǎn)換為并行多點(diǎn)激發(fā)。

針孔陣列：孔徑50μm，共聚焦模式下背景信號降低90%。

自適應(yīng)光學(xué)元件（AO系統(tǒng)）

變形鏡：37-140促動器，實(shí)時校正樣本折射率不均導(dǎo)致的波前畸變。

應(yīng)用場景：類器官深層成像（校正深度＞200μm）。

（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）

鏡片性能優(yōu)化策略

鍍膜技術(shù)：

離子束濺射（IBS）鍍膜：提升紫外波段（＜400nm）透過率至85%以上。

疏水疏油涂層：減少培養(yǎng)液蒸汽污染（接觸角＞110°）。

光路校準(zhǔn)工具：

準(zhǔn)直激光器（635nm）：用于激發(fā)/發(fā)射光路共軸校準(zhǔn)（偏差＜1μm）。

熒光微球標(biāo)樣（如InSpeck系列）：定量檢測系統(tǒng)分辨率與信噪比。

七、典型配置方案

倒置熒光顯微鏡的光學(xué)元件需在長工作距離、高透光率與精準(zhǔn)光譜控制間取得平衡。物鏡的NA與鍍膜質(zhì)量決定熒光采集效率，濾光片組的帶寬與截止陡度影響信噪比，而自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)正推動深層活體成像的邊界。未來，隨著超構(gòu)透鏡（Metalens）與量子點(diǎn)濾光片的成熟，熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)將向更緊湊、多維度探測方向演進(jìn)。